Cell丨张钊组揭秘跳跃基因在卵子发生过程中的完美逆袭以及piRNA调控的必要性——俞洋、张冬雷点评
责编丨迦溆点评丨俞洋（中科院生物物理所研究员）；张冬雷（华中科技大学教授）Barbara Mclintock（19021992），上世纪50年代初在玉米中发现转座子，1983年获得诺贝尔生理或医学奖。上世纪50年代，美国卡耐基研究所遗传系 （此前依附于冷泉港实验室）的Barbara McClintock在玉米中发现了跳跃基因（又被称为“转座子”）。基因组测序的完成使人们意识到在几乎所有物种中，普通基因只占基因组的极少部分(~23%)，而跳跃基因却是基因组中丰度最高的。它们在人类基因组中高达 ～50%。而在有些物种中甚至高达8090%， 例如玉米和蛙类。由于它们的跳跃能够导致基因组损伤和遗传突变，近期研究表明跳跃基因的激活和一些生理病理过程紧密相关，如机体衰老，生殖障碍，癌症或者神经退行性疾病的发生【13】。尽管对跳跃基因的研究有重大的生理学意义，但人们目前还没有能够精确的检测它们的活性。科学家们目前大多只能用mRNA的丰度来预示它们的活性，但我们并不知道它们是在何时跳跃的和怎么实现跳跃的。近日，美国卡耐基研究所胚胎系（目前依附于约翰霍普金斯大学）张钊组（ZZLab）在 Cell上发表了题为Hijacking Oogenesis Enables Massive Propagation of LINE and Retroviral Transposons的最新研究成果。该研究建立了在机体水平上精确检测转座子跳跃的系统方法，揭示了跳跃基因如何利用卵子发生过程实现自己的扩增并导致突变和生殖障碍，为我们理解遗传性基因突变和生物生殖障碍提供了新的方向。由于跳跃基因的潜在危险性，生物体形成了多重防卫系统。在动物生殖系统中，人们发现一类小RNA（piRNA）可能在抑制转座子活性上起到了重要的作用【4, 5】。 据悉，在建立自己的独立实验室之前， 张钊博士一直致力于研究piRNA的生成机制。piRNA 产生的异常会导致转座子mRNA丰度大量增加和动物生殖障碍。由于其特殊的生物学意义，piRNA研究得到了科学家们很大的关注，但我们并不知道在piRNA产生异常的情况下，转座子是否真正的实现了跳跃并导致动物不育。为了解决这个重要生物学问题，张钊组创立了新的科研平台来在单细胞水平上精确的检测转座子的跳跃。利用这套新的平台，他们检测到转座子并不是像科学家们想象的在所有生殖细胞中都进行跳跃。有趣的是，这些跳跃基因进化出了一套极为特殊而高效的系统，能够利用卵子发育过程中的一个较短阶段实现大量的扩增。在动物卵子发育过程中，卵子前体细胞会持续分裂并分化出卵子和抚育细胞（nurse cell）。正如名称所示，抚育细胞负责生成卵子发育所需的蛋白质、RNA和其它营养物质。这些营养物质通过微管传递给发育中的卵子。在卵子发育末期，所有抚育细胞都进行细胞凋亡而只有卵子存活下来【6，7】。张钊组的科研成果表明转座子在卵子前体细胞里并不跳跃。它们等到前体细胞分化出抚育细胞后，在抚育细胞里大量的表达自己的mRNA和蛋白，并可能形成“类病毒颗粒”。但这些转座子产物并不跳跃到生成它们的抚育细胞的基因组里，它们特定的“侵袭”微管转运系统，高效的运输其产物到发育的卵子中。最终只跳跃到卵子的基因组上从而实现完美的逆袭。该文章所揭示的转座子在跳跃水平上的高度的细胞选择性是人们之前并没有想到的。另外，这篇文章表明，如果没有piRNA的保护，转座子在一套基因组上能够实现成千上百次跳跃，产生大量的基因组损伤，从而导致卵子死亡。因而该研究很好的解释了动物为什么要进化出一套特定的piRNA系统来保持生殖细胞基因组的稳定性和完整性。总的来说，该研究创立了研究转座子跳跃的系统工具，发现了转座子能够高效的利用生物机体的发育过程来实现大量的细胞选择性的扩增。为我们深层次的理解生物进化，遗传疾病的发生及生殖障碍提供了新的方向。尽管传统意义上被称为“垃圾DNA”，但近期研究表明转座子在胚胎发育，神经发育，肿瘤生成及机体衰老等生命过程中都可能发挥重要作用。由于其在基因组上的极高丰度和易导致突变的本质，转座子研究必将能够在不久的将来给我们带来更多的新的“惊喜”。据悉，张钊实验室（ZZLab）在研究转座子在生殖系统中的调控的同时，也致力理解于其在体细胞中（尤其是在癌症发生和衰老过程中）的功能。其课题组诚邀有诚之士加盟合作，点击文末“阅读原文”可查看实验室信息。（实验室网页：https://emb.carnegiescience.edu/science/faculty/zhaozhang）！专家点评俞洋（中科院生物物理所、中科院核酸生物学重点实验室研究员，”青年千人“，研究方向：非编码核酸的生物功能和作用机制）Comments：在动物的生殖细胞中，跳跃基因(转座子)必须被严格控制，而转座子的异常跳跃通常会导致动物完全不孕不育。同时，早年研究发现Piwi家族蛋白则是控制生殖细胞中分化发育的关键分子（由Yale/ShanghaiTech的美国科学院院士林海帆老师于1998年首次报道，Cox et al., 1998；Deng & Lin， 2002）。在Craig Mello和Andy Fire报道了RNAi现象之后的几年里，当时还在莫斯科Institute of Molecular Genetics的Vladimir Gvozdev实验室读博士的Alexei Aravin则首次报道在果蝇生殖细胞中，存在着一类非编码小RNA（short Su(Ste) RNAs），并推测它们可能抑制testis特异表达的Stellate基因（Aravin et al., 2001）。也许是为了赶时髦，当时这些非编码小RNA被误认为“siRNA”。而真正建立Piwi家族蛋白跟这类生殖细胞中特殊的非编码小RNA的联系已经是2006年的事了。在2006年6月4号，Gregory Hannon实验室和Thomas Tuschl实验室同时证实了Piwiinteracting RNA的存在，并将其命名为piRNA（Girard at al., 2006 Jun 4；Aravin et al., 2006 Jun 4）。在随后的一周到几个月的时间内，林海帆实验室(Grivna et al., 2006 Jun 9)、Hiroshi Ima实验室 （Watanabe， 2006 Jun 9）、Robert Kingston实验室( Lau et al., 2006 Jun 15)、Philip Zamore实验室（Vagin et al., 2006 Jun 29）和Mikiko Siomi实验室 (Saito et al., 2006 Aug 1)也先后相继报道了动物生殖细胞存在piRNA的工作（见Narry Kim在2006年G&D的Review, 20(15):19937）。通常情况下piRNA通路的失活会导致转座子mRNA在生殖细胞中过表达，与此同时，大家一般能观察到疑似DNA断裂染色（His2Av染色 ）的增加，这些都跟基因组的不稳定性有着密切的关系， 很可能是最终导致动物体不孕不育的重要原因之一（Klattenhoff et al., 2007）。但到目前为止，几乎所有相关piRNA的研究都假定转座子mRNA的表达水平能准确预示转座子跳跃的活性。很少有人直接测量转座子是否能实现真正的跳跃和传代。一个更加重要的问题是，在转座子活化之后，它们会跳到哪里？Carnegie Institute的张钊实验室（ZZLab，https://emb.carnegiescience.edu/science/faculty/zhaozhang）最新发表的Cell文章首次在动物水平给我们提供了详尽的答案。张钊是Phillip Zamore和William Theurkauf的共同博士生，博士毕业后直接独立做了staff associate然后promote成staff meber（相当于PI）。 张钊他们首先利用经典的遗传学手段来激活果蝇里的一种转座子（LINE1 type–Ielement），然后运用自己实验室在果蝇中建立的绿色荧光蛋白和基因组测序方法去跟踪Ielement的跳跃。令人惊奇的是，他们发现Ielement并不是在所有生殖细胞里都进行跳跃（果蝇的生殖细胞由生殖干细胞GSC分化发育而来，最终变为15个Nurse Cell和一个Oocyte）。有趣的是， Ielement转座子能够利用卵子发育过程中产生的Nurse Cell作为工厂来表达他们的m RNA和蛋白质，然后借助转运蛋白通过Ring Canal运输到的卵子（Oocyte）中，最终实现在卵子细胞基因组中的插入。随后，张钊等人进一步研究了其他转座子是否能利用类似的“策略”来实现大量的跳跃以达到扩增遗传到下一代的目的。在piRNA通路被阻断的情况下， 他们发现少数几类逆转录病毒转座子（endogenous retrotransposon）也能插入到卵子细胞中。他们的工作从分子层面解释了为什么piRNA通路突变会导致动物的生殖障碍，也为进一步研究转座子的跳跃机制提供了基础。总的来讲，这项工作在下面三个方面给我们带来了全新的认识：（1）在这项工作之前，人们普遍的认为转座子在所有生殖细胞，如生殖干细胞，Nurse Cell等里都具有跳跃活性。张钊组的研究表明这些自私的跳跃基因能够很好的利用卵子发生过程实现最关键的跳跃，即优先插入能传代的卵子细胞。（2）以前人们往往只停留在检测转座子的mRNA，然后根据mRNA的表达水平推测转座子的活性。这篇新的研究表明即使许多转座子mRNA增加后，也不能完成跳跃。所以依据mRNA丰度来预测转座子活性并不可靠。（3）piRNA因其能抑制转座子活性而得到人们的大量关注。有趣的是，这篇文章发现在piRNA受阻的情况下，很多转座子依然无法在生殖干细胞里进行跳跃。那么除了piRNA，生殖细胞是否还有其他的途径来抑制转座子跳跃呢？这个通路有无可能是endosiRNA通路呢（Czech et al., 2008; Tam et al., 2008；Ghildiyal et al., 2008; Kawamura et al., 2008; Okamura et al., 2008）?仔细想一下，在漫长的进化过程中，这些转座子真心变得很“聪明”，因为它们似乎知道只有跳跃到未来的配子里面才能实现自身的复制。当哺乳动物受精卵进入早期胚胎发育时期, 转座子也会在ZGA的时候大量激活（e.g. Grow et al., 2015; Wu et al., 2016; Lu et al., 2016； Liu et al., 2016; Zhang et al., 2016; Dahl et al., 2016），这个时期的转座子如何被控制，是否或如何跳跃 ，它们的活化是否有着更深层次的生物学意义都是亟待深入研究的问题。在这个方面，最近的研究似乎表明过量表达的LINE1的RNA能跟nucleolin形成复合物，而这个复合物有可能是小鼠早期胚胎正常发育所必须的（e.g. Percharde et al., 2018）。专家点评张冬雷（华中科技大学同济医学院基础医学院教授，着重于piRNA这一类非编码小RNA调控其靶基因表达的分子机制的研究）Comments：由于细胞异质性（heterogeneity）广泛存在于原核细胞和真核细胞群体中，因此在单细胞水平上的分析（single cell study）可能会发现在研究细胞群体时很难被认知的现象。本期Cell杂志（Cell 174, 2018）上Carnegie Institution for Science张钊课题组的文章通过在单细胞水平对转座子转座活性的分析，成为此类研究的一个优秀案例。众所周知，真核细胞基因组中含有非常高比例的转座子及其相关序列，如高达60%的人类基因组序列由转座子及相关序列组成，转座子的转座活性（尤其是在生殖细胞中的活性）会造成基因组完整性的确实，因此在生殖细胞中抑制转座子的活性对基因组的稳定遗传至关重要。张钊课题组通过果蝇卵子发生过程中的转座子转座活性的单细胞水平研究，发现了隐藏着的一个有趣现象。他们富有想象力的构建了一个基于GFP的报告基因，只有当转座子发生转座时，该GFP报告基因才会表达，因此可以通过显微镜观察果蝇卵子发生过程中GFP的表达情况，获得到单细胞水平转座子的转座信息。他们发现转座只在卵母细胞（oocyte）中发生，而不再营养细胞（nurse cell）中发生。以此为启发，他们通过抑制piRNA通路来激活果蝇内源转座子，并分析了这些转座子的转座情况，发现这是一个相对普遍的现象，尤其对于LTR和LINE类型的转座子来说。他们进一步证明了这些转座子的转录发生在nurse cell，转录本通过微管介导的运输系统进入oocyte，之后插入到oocyte的基因组中。转座子，作为病毒的一种原始形态，只有进入生殖细胞，才能通过宿主的繁殖而使自己的基因组得以最大程度的繁衍。在果蝇胚胎的正常发育过程中，nurse cell的作用即为合成oocyte发育所需的各种物质，并通过细胞之间的连接进行物质运输，保证oocyte的正常发育。这里充分体现了入侵核酸和宿主之间的协同进化关系，即入侵核酸可以利用宿主自身进化出的机制来进行繁衍。果蝇转座子这一在不同细胞中的转座异质性在之前的研究中一直被忽视，该研究提出了转座子进行繁衍和传播的新观点，使我们进一步认识到了生命的精巧和复杂。值得注意的是，该研究更为细致的定义了“转座子活性”这一概念，即传统方法通过mRNA的水平来定义转座子的活性是不准确的，因为该研究发现转座子mRNA的水平和转座子插入基因组这一事件是没有相关性的，而显然只有当转座子重新插入基因组，才是转座子活性的最终体现。这意味着以后研究人员进行其他转座子相关研究时，需要首先确认转座子转录活性和基因组插入活性的相关性。由于人类基因组中存在大量LTR和LINE类型转座子，因此值得进一步研究的是，是否在高等生物中也存在此类异质性的现象。另外，该研究指出，在转座子发生转录的nurse cell内，存在某种独立于piRNA通路以外的机制抑制了转座子重新插入到nurse cell的基因组，对该机制的进一步研究，将会使我们对转座子有更深入的认识，而且必将对包括基因重组、病毒入侵、转座子相关疾病等方面的研究产生重要影响。通讯作者简介张钊，本科就读于山东农业大学（20012005），硕士毕业于北京师范大学（20052008），于2014年获美国麻省大学医学院博士学位。2014年11月起任美国卡耐基研究所胚胎系独立研究员（PI）。2015年获美国NIH “Director’s early independence aeward”资助（2015年2020年）。更多实验室详情：https://emb.carnegiescience.edu/science/faculty/zhaozhang参考文献1. 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