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上海海洋大学硕士学位论文斑马鱼卵母细胞体外培养条件优化及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)调节其减数分裂恢复作用姓名:吕众申请学位级别:硕士专业:水生生物学指导教师:魏华20080512斑马鱼卵母细胞体外培养条件优化及丝裂原活化蛋白激酶调节其减数分裂恢复作用初探摘要一消化酶综合分离法..6捎没捣掷敕ê突礯消化酶综过程中,分离卵母细胞的方法及诱导激素的选择是本实验的关键问题。本文对体养后的存活率%灾嘤诨狄幌缸酆戏掷敕.ァ%,尸丝裂原活化蛋白激酶—,且焕嗨堪酸苏氨酸激酶,广泛存在于细胞中参与细胞多项功能。近期研究表明,信号通路在卵母细胞减数分裂过程中发挥重要作用。本文以斑马鱼卵母细胞体外培养成熟系统为基础,利用方法在卵母细胞发生生发泡破裂珿前后测定活化的.谋泶锴榭觯使用上游激酶的拮抗剂蛈抑制的激活,同时检测卵母细胞发生的情况,以此来推断对斑马鱼卵母细胞减数分裂重新启动的作用。第一部分:建立斑马鱼卵母细胞体外培养成熟体系。在体外培养卵母细胞的外培养斑马鱼卵细胞的分离方法和诱导激素进行了对比和筛选。结果表明,在卵母细胞的分离过程中,机械分离法获得的卵细胞的完整率甇%蚻∈媾.5ɑ捣掷敕ㄆ骄掷朊扛雎严赴玫氖蔽灾嘤诨合分离法对所获卵细胞在时后的成熟度%、.无显著差异。在培养液中分别添加窃型.不4贫甧街执萍に兀菹允荆窃型E嘌褐校呗碛懵涯赶赴墒炻蚀ヒ陨纤需要的时间为保飨陨儆痬.雌二醇组涂瞻锥哉兆7直鹨/、/、痬痬一双羟孕***培养液培养卵母细胞,时其成熟率分别为.ァ%、.ァ%。显著高于培养于相同浓度的贫寂嘌褐械穆涯赶赴腉.ァ.ァ%、.。结果表明,窃型6园呗碛懵涯赶赴某熟促进作用比.雌二醇显著;且两种激素都在低浓度痬时有更好的成熟促进效果。上海海洋人学硕十学位论文猟一/况。实验结果表明,不同于卵母细胞发生的趋势,的大量磷酸化发第二部分:建立了斑马鱼卵母细胞中磷酸化的检测方法。实验采用方法检测卵母细胞中的磷酸化,针对斑马鱼卵母细胞的特点对检测过程中的干扰因子及灵敏度进行了探讨。结果表明,采用纯手工尖镊分离法与机械吹打分离法对卵母细胞中磷酸化的表达有显著区别。机械吹打可以造成的激活,从而干扰对正常条件下卵母细胞中存在的磷酸化的检测。此外,分离卵母细胞是所获得的另一种大量存在的细胞一卵颗粒细胞也是干扰正常检测的一个因素。实验结果表明,在斑马鱼卵母细胞发生前后较短的时间内,磷酸化表达量远大于磷酸化的的量,而在颗粒细胞中,衣时有大量表达,其中磷酸化在颗粒细胞和卵母细胞中的表达有明显差异。此外,实验还对方法对检测斑马鱼卵母细胞中磷酸化的灵敏度作了测验。在牧呀庖合∈团ǘ认拢、个卵母细胞中所能检测的甅泶锪勘砻鳎辽僭雎涯赶赴锌以清楚地检测出磷酸化在斑马鱼卵母细胞中的真实表达情况。第三部分:检测了斑马鱼卵母细胞发生过程中磷酸化的表达情生在卵母细胞发生的相对缓慢期,且在被大量磷酸化后的蹦冢率迅速上升。在上游激酶卓蛊險的抑制作用下,卵母细胞大量发生的时间延后了时,且最终的%也比空白对照组%。此外,根据实验结果,在卵母细胞完成∈焙螅的表达量开始下降,完成、时后,开始有少量表达,且与甅汲苫郝龆嗲魇啤关键词:丝裂原活化蛋白激酶,减数分裂,生发泡破裂,斑马鱼,卵母细胞上海海洋人学硕十学位论文:痬甌.甅.,.瓾.%..狤一,荆,一籶一籵,一,一%%、ァ%、.—%、.ァ%、..籈痬.上海海洋人学硕十学位论文瑃·%..ィ甌..ィ瓸痬%痬疶甌..琹瓵。瑆痬痬,瓵:甌.狹.,,瓹,篗珿瑉,上海海洋入学硕十学位论文,.,%%瓸,瑃..,,.日期:***年‘月同期:为哆年‘月学位论文作者签名:与钍日期:゜学位论文作者签名::≥镢上海海洋大学学位论文原创性声明上海海洋大学学位论文版权使用授权书年解密后适用本版权书。本学位论文属于保密,在不保密指导教师签名;本人郑重声明:我恪守学术道德,崇尚严谨学风。所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究:魉〉玫某晒3闹幸丫魅纷⒚骱鸵玫哪谌萃猓韭文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写,我对所写的内容负责,并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印什和电子版,允许论文被奄阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采坝⑺印或扫描等复制手段保存利汇编本学位论文。口汉:Q笕搜叮甀宦畚第一章文献综述引言涯赶赴某墒旒暗骺匾蜃在有性生殖中,生物体都是由精子和卵子结合成的受精卵发育而成。组成受发育而来。与产生一般的体细胞的有丝分裂不同,性细胞通过特殊的使染色体数减半的减数分裂而产生?。这其中,卵母细胞担任着受精及指导胚胎发育的重任,因此,卵母细胞的发育、成熟过程是一个复杂的、多因子调节过程,多年来一直珿,经过长时间的休眠以后,当生物体性成熟,卵母细胞在激素作用下进入生长期,卵母细胞体积快速增加。接近一极体=氲诙渭跏至押螅涯赶赴滞V驮诜至阎衅冢匦朐诰或化学信号的作用下,‘能完成第二次成熟分裂。卯母细胞成熟的概念卵母细胞的成熟足指卵母细胞获得完成减数分裂、为受精及胚胎发育做好准备的能力‘,是完成『J芫?霸缙谂咛シ⒂匦氲摹R话憷此担涯赶赴卵母细胞的核成熟在形态上表现为生发泡破裂和第一极体的排出。精卵的两种细胞被特定的称为性细胞,它们都是由生殖原细胞是生殖生物学、发育生物学研究的热点。卯母细胞发育周期在大多数脊椎动物,在胚胎期或出生后不久,卵母细胞便停止有丝分裂,进入减数分裂,并停滞于第一次减数分裂前期的双线期【俊T谛矶喽铮谕V推细胞核明显,称为生发泡生长期结束时,在促性腺激素的作用下,卵母细胞开始恢复第一次减数分裂,发生明显形态变化:生发泡破裂珿,核仁消失,排出第成熟包括细胞核成熟和细胞质成熟。.赴顺墒成熟期的卵母细胞在外来信号的刺激下细胞核膜破裂、核仁消失、核内物质与核质混合,此过程即为生发泡破裂。发生时,染色质向核膜侧扩散迁移,上海海洋人学硕士学位论文一叫细胞减数分裂的恢复和开始。不同动物卵母细胞发生的时间并不一致,在体外培养卵母细胞成熟的实验中,大鼠需要时,猪需要~保窖蛞话】,鱼需薄R话愣裕珿砺涯赶赴跏至训拇有缕舳伴随着减数分裂的进行,卵母细胞在动物极附近排出第一极体。此时的卵母细胞位于第二次减数分裂的中期,等待受精。第一极体的排放,标志着卵母细细胞质的成熟是一系列复杂的生理生化过程,目前研究表明,胞质成熟还没核仁越来越小,同时核膜打折。核仁的消逝,随即核膜破裂【俊曛咀怕涯需要胞的核已成熟图卵母细胞的细胞核成熟的不同阶段.赴食墒有明确的判断标准。目前,胞质成熟的时细胞发生的形态学变化在哺乳动物中研究的较多。处于成熟阶段的卵母细胞,壁层的颗粒细胞与卵丘细胞之⒖贘,卵丘细胞与.上海海洋人学硕十学化论文.:,甋猯维剁。在排卵之前,缝隙连接急剧下降。排卵刺激之后,每个卵丘细胞缝隙连接下则为胞质成熟,位于中部或由正中部向边缘迁移则为胞质未成内容来自淘豆网www.taodocs.com转载请标明出处.